Prof. Francisco Carlos Faria Lobato¹ e Ronnie Antunes de Assis²

¹ Professor da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais
² Mestrando em Medicina veterinária Preventiva da Escola de Veterinária da UFMG

Doenças neurotrópicas.

Botulismo
O diagnóstico do botulismo é baseado na anamnese, sinais clínicos, isolamento e principalmente na demonstração e identificação das toxinas produzidas. Os espécimes de eleição são: soro, conteúdo intestinal, ossos e alimentos suspeitos. A técnica mais utilizada é a soroneutralização em camundongos. Uma vez que haja suspeita da presença da(s) toxina(s), o que é verificado pela morte dos camundongos, a identificação da mesma(s) é feita com anti-soros específicos (Smith, 1984). Atualmente, tem-se utilizado a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), que permite por meio de primers de oligonucleotídeos, detectar os genes responsáveis por codificar a produção da(s) neurotoxina(s) (Fach et al., 1993; Szabo et al., 1993; Franciosa et al., 1994).

Tétano
No tétano, o diagnóstico laboratorial é semelhante ao botulismo, sendo a demonstração da neurotoxina o mais empregado. Entretanto, na maioria dos casos, o diagnóstico está baseado apenas na anamnese e na sintomatologia clínica, sem referência a testes laboratoriais (Quinn et al, 1994).

Mionecroses (carbúnculo sintomático x gangrena gasosa)
Diferentemente do botulismo, tétano e enterotoxemias, em que a detecção da(s) toxina(s) produzidas pelos agentes envolvidos é imprescindível para o diagnóstico, no caso das mionecroses, a detecção dos agentes é suficiente para o diagnóstico. Além da anamnese, sinais clínicos, achados de necrópsia e isolamento dos agentes envolvidos, podem ser empregadas as seguintes técnicas: imunofluorescência direta (IFD) (Batty & Walker, 1963; Pinto & Abreu, 1992) que permite a detecção dos agentes em esfregaços de cultivo e em impressões obtidas diretamente dos tecidos durante a necropsia; a imunohistoquímica (IHQ), em cortes histológicos e/ou esfregaços de cultivo (Conesa et al., 1995., Vannelli & Uzal., 1996., Vannelli & Uzal., 1996), e a PCR, que amplifica seqüências conservadas da subunidade 16sRNA (Kuhnert et al., 1997; Takeuchi et al., 1997).

Enterotoxemias
Dentre as clostridioses, as enterotoxemias sem dúvida são as que mais chamam a atenção de produtores e veterinários. Um fator de grande discussão no campo diz respeito ao diagnóstico da enterotoxemia bovina. Até o presente momento, existe uma baixa freqüência de diagnóstico laboratorial de enterotoxemia bovina no Brasil. Pelo fato do C. perfringens ser um comensal do trato gastrointestinal, apenas o isolamento do microrganismo não é suficiente para o diagnóstico. O diagnóstico confirmatório está na dependência direta da detecção das toxinas produzidas pelo agente, e isto geralmente ocorre apenas em condições não-fisiológicas.

A detecção de toxinas em conteúdo intestinal é o critério mais aceito atualmente. O método convencional para detecção destas toxinas é o teste de soroneutralização em camundongos. Entretanto, devido a discussões éticas por parte de grupos humanitários, está sendo gradualmente substituída por metodologias in vitro, como por exemplo a técnica de ELISA (Weddell & Worthington., 1984; Nagahama et al., 1991; El idrissi & Ward., 1992a,b).
No caso da enterotoxemia caprina e ovina, além da pesquisa de toxina(s) nos fluidos intestinais, alguns achados podem dar suporte ao diagnóstico definitivo da enfermidade. Em caprinos, a enterotoxemia é principalmente caracterizada pela ocorrência de enterocolites (Uzal & Kelly, 1998). Nos ovinos, a toxina épsilon de C. perfringens tipo D produz alterações nas células endoteliais do cérebro que levam ao aumento da permeabilidade vascular, produzindo edema cerebral. A alteração histológica mais precocemente observada como conseqüência a esse processo é o edema proteináceo perivascular. Se os animais sobrevivem por períodos maiores que 24 horas, pode-se observar malacia, que, em casos severos, pode ser observada macroscopicamente, caracterizando a encefalomalacia simétrica focal. (Uzal & Kelly., 1997).

A presença das toxinas beta e épsilon no conteúdo intestinal é o diagnóstico de certeza das enterotoxemias. Entretanto, é recomendável associar este achado com o histórico, sinais clínicos e achados de necropsia.

Hepatite necrótica e hemoglobinúria bacilar
Essas enfermidades geralmente são de localizações geográficas limitadas, estando associadas a áreas úmidas e à presença de infecções por Fasciola hepática.

O diagnóstico da hepatite necrótica é feito a partir do isolamento e posterior identificação do agente envolvido pela técnica de IFD (Sterne & Batty, 1975). No diagnóstico da hemoglobinúria bacilar, além do isolamento e da IFD, tem sido utilizada a técnica de IHQ (Uzal et al., 1992).

Em relação às clostridioses no Brasil, existem poucos relatos da confirmação laboratorial destas enfermidades. As evidências de ocorrência estão relacionadas com os sinais clínicos, que são pouco conclusivos. Ao fazermos uma revisão da literatura brasileira, verificaremos que pouco progresso tem sido feito na busca de novos métodos de diagnóstico. O diagnóstico laboratorial é feito a partir do isolamento e da caracterização bioquímica dos agentes envolvidos (Correa et al., 1980; Baldassi et al., 1985; Silveira et al.,1995). Entretanto, freqüentemente estes procedimentos não apresentam bons resultados devido às dificuldades na obtenção, envio e processamento das amostras no laboratório. Dependendo das condições em que chegam, o isolamento pode ser dificultado. Além desse fato, a maioria dos clostrídios são extremamente sensíveis a oxigênio, tendo seu crescimento facilmente superado por outros microrganismos presentes nas amostras. No campo, a situação não é diferente, onde o diagnóstico é dado pelos veterinários com base apenas nos sinais clínicos e/ou lesões de necropsia.

Em razão da dificuldade para o isolamento de clostrídios, é necessária a implementação de novos métodos de diagnóstico, que possibilitam a identificação dos agentes e de suas toxinas. A implementação de técnicas como a imunohistoquímica para o diagnóstico das mionecroses, metodologia esta já disponível em nosso meio, e a substituição da soroneutralização em camundongos por métodos in vitro como o teste de ELISA, permitirá um diagnóstico mais rápido e específico, o que por sua vez permitirá determinar a real prevalência desses agentes em nosso meio. Esta informação, por sua vez, será extremamente útil para tomada de decisões em relação à fabricação e ao uso de vacinas contra estas enfermidades.

Controle de qualidade das vacinas

As enfermidades causadas por microrganismos do gênero Clostridium levam a perdas consideráveis no rebanho, uma vez que o tratamento na grande maioria dos casos é impraticável. Devido às características ecológicas dos agentes, que são ubiqüitários do trato digestivo dos animais e do solo, e pela forma de resistência na natureza por meio de esporos, a erradicação das enfermidades é praticamente impossível. O controle e a profilaxia devem pois basear-se em medidas adequadas de manejo e em vacinações sistemáticas de todo o rebanho, pois os animais estão em permanente contato com os agentes e com os fatores que poderão desencadear as enfermidades.

A eficiência das vacinas clostridiais relaciona-se à natureza do(s) antígeno(s) que as compõe(m), sendo estes toxóides e/ou bacterinas. Elas são de natureza altamente antigênicas, quando bem elaboradas, oferecendo boa proteção aos animais. As vacinas comerciais são combinadas ou compostas por múltiplos antígenos e são usadas como estratégia frente a uma grande variedade de agentes e/ou suas toxinas que podem participar das enfermidades (Tab.2).

Nos últimos anos, houve uma crescente ampliação dos sistemas de criações de animais domésticos. A alta concentração de animais implica ter-se uma proteção em massa frente a uma série de enfermidades que passaram a ser comuns com as novas técnicas de manejo implantadas. A tendência atual é a utilização de vacinas combinadas reunindo antígenos contra várias enfermidades em um único produto. Esta prática visa minimizar os problemas de estresse e manejo, assim como evitar reações do tipo das anafiláticas à inoculação de produtos tóxicos, inflamações locais, traumas de inoculações, reações aos adjuvantes, dor e febre entre outros (Horsch., 1984; Pinochet & Abalos., 1989: Pinochet et al., 1992). Entretanto, para alguns autores, a aplicação de vacinas combinadas ou simultâneas pode apresentar incompatibilidades ou interferências que podem impedir a estimulação de uma boa imunidade, comparada à das vacinas chamadas únicas ou monovalentes (Green et al., 1987., Roitt, 1994). Para evitar a incompatibilidade ou interferência entre os diversos antígenos de uma vacina, as combinações deverão ser previamente testadas antes de ser empregadas na rotina dos programas de controle e profilaxia das enfermidades, de acordo com normas aceitas internacionalmente.

Fatores relacionados à produção e ao controle das vacinas

A produção de toxinas por Clostridia é um dos aspectos mais importantes a ser considerado na linha de produção de toxóides eficientes (Smith, 1977). As amostras sementes utilizadas, a composição dos meios de cultura, pH, tempo, temperatura e atmosfera de incubação são fatores importantes e devem ser rigorosamente controlados para uma efetiva produção de vacina.

Sabe-se que a produção das toxinas na grande maioria das espécies patogênicas deste gênero está relacionada com infecção das células bacterianas por bacteriófagos ou plasmídeos. Repiques sucessivos destas amostras in vitro podem levar à perda destes mediadores de produção de toxinas, acarretando baixos títulos ou mesmo a perda total da toxigenicidade das amostras (Hatheway, 1990).

Os meios de cultura deverão conter fontes de aminoácidos utilizáveis pelos clostrídios, podendo estes serem sintéticos, infusão de carne ou pedaços de carne cozida que também propiciam ambiente de anaerobiose. A presença de carboidrato no meio de cultura como fonte de energia podem influenciar o crescimento e a produção de toxinas. Concentrações de glicose entre 1%–2% apresentam melhores resultados de produção (Jansen, 1961, Pivnick et al 1964; 1965). A presença destes carboidratos favorece a produção de gases como H2 e CO2, que por sua vez ajudam a manter ambiente de anaerobiose (Rood & Cobe., 1991).

Entretanto, a presença destes gases leva à acidificação do meio, interferindo na produção de toxinas, sendo este um dos pontos críticos na obtenção de culturas altamente tóxicas. O pH do meio utilizado deve ser mantido em torno da neutralidade para produção de toxinas pela grande maioria dos clostrídios (Smith, 1977).

O período de incubação também é um fator a ser considerado tanto na produção quanto na estabilidade das toxinas produzidas. Este é variável com a espécie. Por exemplo a produção máxima de beta toxina por C. perfringens tipo C é obtida quando as culturas são incubadas por um período de 4 a 8 horas e para produção de épsilon toxina por C. perfringens tipo D é entre 5 e 12 horas (Sakurai & Duncan.., 1979). Períodos superiores poderão acarretar a degradação das toxinas por ação de outras substâncias produzidas por estes agentes.

Entre os clostrídios, apesar de serem anaeróbios estritos, existe uma variação em relação à sensibilidade ao oxigênio. C. botulinum e C. haemolyticum, entre outros, são sensíveis a taxas de oxigênio residual superiores a 0,5 %. Por sua vez, C. perfringens são mais aerotolerantes. Conseqüentemente a manutenção de atmosfera de anaerobiose é também fator preponderante na produção de toxinas (Smith., 1977). Esta poderá ser mantida com utilização de compostos químicos geradores de anaerobiose, misturas gasosas ou meios de cultura contendo partículas de carne.

A produção de toxinas pelas diversas espécies de clostrídios é um processo laborioso que requer metodologias adequadas, dentre estas a utilização de fermentadores que permitem o monitoramento de grande parte destes fatores.

No Brasil, atualmente está havendo um incremento na produção de vacinas indicadas para clostridioses. Isto se deu em razão das modificações ocorridas nos sistemas criatórios do País, levando ao surgimento de novas enfermidades e recrudescimento de outras.

Um outro aspecto importante em relação às vacinas clostridiais é a inexistência de controle oficial que ateste a qualidade quanto à inocuidade, esterilidade e potência de todos os antígenos. Atualmente, apenas C. chauvoei e toxóide botulínico tipos C e D são avaliados sistematicamente pelo Ministério da Agricultura e do Abastecimento, sendo portanto a qualidade dos produtos deixados a cargo das indústrias produtoras (Lobato e Assis, 2000).

Ainda em relação ao controle de qualidade das vacinas clostridiais, é importante mencionar que, para a avaliação da potência das mesmas, o método convencionalmente utilizado, a soroneutralização em camundongos, está sendo gradualmente substituído pelas técnicas in vitro. Dentre elas, pode-se citar como exemplo, o ELISA, empregado para detecção de anticorpos produzidos contra a toxina épsilon de C. perfringens tipos C e D (Sojka., 1989; Uzal et al., 1997, Parreiras, 2001), e o emprego de cultivos celulares (Knight et al., 1990).

As vacinas clostridiais devem ser adminsitradas por via subcutânea, preferencialmente, em duas doses intervaladas de 4-6 semanas na primovacinação e reforço anual, com exceção de C. haemolyticum, que deverá ser semestral. Quando o rebanho é sistematicamente vacinado, os anticorpos colostrais protegem os bezerros por até 3-4 meses após o nascimento, devendo então a primovacinação ser realizada após este período (Roussel & Herdje, 1990).

Para que o controle das clostridioses seja eficiente, deve-se aliar, à pratica de vacinações, medidas de manejo que visem reduzir os fatores que poderão predispor a ocorrência dessas enfermidades.

Tabela 2

Composição antigênica para vacinas clostridiais.

		Tipo de vacina
Doença	Agentes envolvidos	Bacterina	Toxóide
Carbúnculo Sintomático	C. chauvoei	+	-
Gangrena gasosa	C. Septicum	+	+
	C. perfringens tipo A	+	.+
	C. Sordellii	+	+
	C. novyi tipo A	+	+
Enterotoxemia	C. Perfringens tipos B, C e D	-	+
Botulismo	C. botulinum tipos C e D	-	+
Tétano	C. tetani	-	+
Hemoglobinúria bacilar	C. haemolyticum	+	-
Hepatite necrótica	C. novyi tipo B	+	-

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