O objetivo do presente estudo foi determinar os efeitos do desafio direto de aerossol com o vírus da IBR e da BVD em bezerros de corte desmamados, vacinados e não vacinados. Dados de morbidade e de mortalidade foram coletados e usados para avaliar as respostas de cada grupo de tratamento ao desafio dos vírus. Este estudo apóia o uso de vacinas conjugadas de vírus vivos modificados e vírus mortos para o controle de IBR e BVD na doença respiratória induzida em bezerros desmamados.

MATERIAIS E MÉTODOS
Sessenta e quatro bezerros de corte cruzados foram usados neste estudo. Os bezerros eram originários de uma fazenda do Leste do Texas e foram selecionados como soronegativos ao IBR, BVD e BRSV. As soroatividades foram determinadas por soroneutralização de uma avaliação de amostras de soro, coletadas 2 semanas antes do início do estudo (Tabela1). No período de avaliação da amostragem os animais foram identificados com brincos numerados seqüencialmente, conforme chegavam ao desembarcador. A distribuição dos animais nos tratamentos foi aleatória, cega e baseada somente no número do brinco.
Os bezerros do Tratamento I receberam uma vacina multivalente contendo o vírus da IBR-PI3, quimicamente alterados (termossensível), vírus da BVD inativados, vírus da BRSV vivos modificados e 5 serovares de Leptospira.
O tratamento II recebeu uma vacina contendo vírus da IBR-BVD-PI-BRSV, todos mortos, mais 5 serovares de Lepstospira.b Os bezerros do tratamento III não foram vacinados e serviram como controle negativo para o estudo (Tabela 2). As vacinas foram administradas conforme especificações de bula do fabricante.
Os bezerros receberam tratamento inicial apropriado 18 dias antes do desmame e retornaram ao rebanho (23/11/90) (Tabela 3). Foram desmamados e transportados ao Agri Research Center, localizado a três milhas a noroeste de Canyon, Texas, em 11 de dezembro de 1990, onde receberam vacinações de apoio baseadas no grupo de tratamento e foram colocados em baias separadas em 12 de dezembro de 1990. O manuseio e a observação dos animais foram feitos de acordo com os procedimentos-padrão de manejo, do processamento ao desafio viral, em 12 de janeiro de 1991. Dois animais foram removidos do Tratamento II antes do desafio – um por doença e outro por doença respiratória não responsiva – e foram, assim, excluídos do estudo.

TABELA 1 - TITULAÇÕES DA MÉDIA GEOMÉTRICA

TABELA 2 - GRUPOS DE TRATAMENTO

TABELA 3 - CRONOGRAMA DE EVENTOS

Em 12 de janeiro de 1991, os bovinos foram expostos a 2x108 TCID do vírus da BVD, cepa New York-1 e 2x109,4 TCID de vírus da IBR, cepa Cooper. Um total de 4 mililitros da mistura de vírus foi administrado em múltiplas pequenas doses, via aerossol, com metade da dose sendo aplicada em cada narina.
A temperatura individual foi diariamente aferida por 7 dias consecutivos após desafio.
Após o dia 7 do desafio, os animais que exigiram tratamento foram manejados como casos rotineiros de doença respiratória. O tratamento administrado foi baseado em procedimentos-padrão para os animais do estudo. Todos os animais foram observados e manejados como animais de pasto, normalmente, do sétimo dia pós-desafio até o final do estudo. O estudo foi conluído 21 dias pós-desafio em 2 de fevereiro de 1991.
Os dados de morbidade e mortalidade foram coletados e tabulados. Análise ao método Qui-Quadrado foi realizada com dados apropriados. Os resultados de necropsia foram coletados e avaliados.

RESULTADOS
Os dados de mortalidade por tratamento estão apresentados na Tabela 4 e no Gráfico 1. Pode-se observar que nenhum dos 26 (0%) bezerros do Tratamento I morreram, enquanto 3 de 24 (13%) dos bezerros do Tratamento II e 7 de 12 (58%) do Tratamento III morreram.

TABELA 4 - MORBIDADE E MORTALIDADE

Gráfico 1 - Porcentagem de morbidade e mortalidade por grupo de tratamento

A causa, bem como os dados individuais das mortes dos animais, podem ser visto na Tabela 5. O tempo para exposição do vírus até a morte do primeiro e do último foi de 10 a 18 dias, respectivamente. O tempo médio de desafio ao víruis até a morte foi de 13 dias. Houve envolvimento consistente do trato respirátotio (consolidação e hemorragia) e do trato digestico (ulceração e edema das dobras do abomaso) nos animais necropsiados (Tabela 5). Necropsia macroscópica das lesões foi consistente com relatórios publicados para doença respiratória bovina envolvimento de IBR e BVD.1,2
Tecidos dos animais 51 e 8 foram submetidos ao Laboratório de Diagnóstico Médico-Veterinário do Texas para isolamento de vírus. O animal 8 produziu vírus IBR no pulmão, traquéia, nódulos linfáticos do mediastino, abomaso e intestino delgado.
O animal 51 produziu vírus BVD dos nódulos linfáticos e do intestino delgado. A análise com o MÉTODO Qui-Quadrado foi realizada sobre dados de mortalidade (Tabela 4). Foi encontrada diferença estatisticamente significativa para redução de mortalidade no Tratamento I quando comparado aos Tratamentos II e III (p<0,0001). A redução da mortalidade no Tratamento II versus Tratamento III também foi estatisticamente significativa ( p<0,0001). A morbidade foi determinada por resposta febril (Tabelas 6 e 7) e a necessidade de tratamento individual para doença respiratória (Tabela 4 e Gráfico 1). No dia 2 pós-desafio, todos os grupos estavam mostrando um aumento na temperatura retal média (Tabela 7).


TABELA 5 - PERDA POR MORTE: DATA E CASO

Traquéia - Petéquias e hemorragias ecmóticas de brandas a extremas; fivrina de branda a extrema.
Pulmões - Hemorragia vermelha escura com edema e consolidação, com envolvimentos maiores do que 20%.
Cavidade oral - De normal à hemorragia petequial a pequenas ulcerações.
Abomaso - Consistemente inflamado e geralmente edematoso - úlceras alongadas nas dobras.
Intestino - Geralmente inflamado.

** Além das lesões por IBR/BVD havia evidências de Pasteurella.

TABELA 6 - TEMPERATURAS CORPORAIS INDIVIDUAIS DO DIA 3 AO DIA 5 PÓS-DESAFIO

TABELA 7 - MÉDIA DIÁRIA DAS TEMPERATURAS CORPORAIS * POR GRUPO DE TRATAMENTO

A temperatura média no Tratamento I continuou a subir, alcançando o pico de 39,7ºC no dia 4 pós-desafio e retornando à linha de base no dia 7 pós-desafio. As temperaturas dos bovinos nos Tratamento II e III alcançaram um nível mais alto e persistitram por mais tempo do que a resposta registrada para o Tratamento I.
A Tabela 6 representa temperaturas médias de 3 dias, do dia 3 ao dia 5 pós-desafio. Houve uma redução significativa no número de animais do Tratamento I, mostrando temperaturas mantidas de 39,9ºC quando comparado aos Tratamentos II e III (p<0,0001). A diferença entre os Tratamentos II e III com relação ao número de animais com temperaturas mantidas de 39,9ºC durante o período de 3 a 5 dias pós-desafio não foi estatisticamente significativa (p>0,1). No dia 7 pós-desafio, os animais que exigiam tratamento individual para doença respiratória foram identificados e tratados (Tabela 4). Dois de 26 (8%) dos animais do Tratamento I foram tratados individualmente. Oito de 24 (33%) e 12 de 12 (100%) dos bezerros dos Tratamentos II e III, respectivamente, exigiram tratamento individual para doença respiratória.
Diferenças estatisticamente significativas foram demonstradas com relação à redução de animais exigindo tratamentos com antibióticos no Tratamento I versus II (p<0,025) e III (p<0,0001) e para o Tratamento II versus III (p<0,0001) (Tabela 4). Observou-se também diferença estatisticamente significativa para a redução no número de animais no Tratamento I quando comparado aos Tratamentos II e III, mostrando manutenção da temperatura corporal de 3 a 5 dias pós-desafio (p<0,001) (Tabela 6).

DISCUSSÃO
O envolvimento de mais de um vírus durante surto de doença respiratória bovina geralmente resulta em aumento da severidade da doença clínica. 3,4,5 Na tentativa de simular a experiência clínica na chegada de novos bezerros desmamados entrando em confinamento comerciais, e aumentar a probabilidade de gerar suficiente doença clínica, possibilitando a diferenciação entre os tratamentos, ambas as viroses IBR e BVD foram usadas neste estudo de desafio. Este método de desafio foi muito eficaz na geração da doença clínica, aproximando a realidade de bezerros em condições naturais de criação durante o período de outono e foi um bom modelo de desafio na avaliação das vacinas.
A avaliação final da eficácia da vacina é sua habilidade de proteger sob desafio significativo. Dos resultados, fica evidente que foi significativo o desafio do vírus de IBR e de BVD. Os resultados também indicam que a vacinação com qualquer dos produtos testados foi altamente efetiva na limitação de morbidade e mortalidade. Além disso, o vírus quimicamente alterado (termossensível) de IBR e PI3, o vírus vivo modificado da BRSV e a vacina de vírus morto da BVD (Tratamento I) mostraram redução significativa da morbidade e da mortalidade comparadas à vacina de vírus mortos (Tratametno II).
As diferenças notadas na eficácia entre as duas vacinas podem resultar de processos imunológicos de vacinas de vírus morto versus vacinas de vírus vivo modificado e alterado quimicamente. Não há diferença significativa entre a resposta sorológica dos dois grupos vacinados contra IBR e BVD (Tabela 1). Isto sugeriria que ambos os produtos foram capazes de estimular uma resposta humoral imune (HI). O desenvolvimento de uma resposta imune mediada por células (CMI)não pôde ser documentado por estes dados; entretanto, diversas informações são conhecidas sobre o desenvolvimento da CMI e resposta HI.
Sabe-se que os linfócitos T citotóxicos são parte importante da resposta celular (CMI) a infecções6 virais. Além disso a ativação de CD8+ ocorre apenas quando ela reconhece os antígenos virais sintetizados, endogenamente associados com um Complexo de Histocompatibilidade Maior classe I (MHC I). Estes antígenos virais são produzidos durante infecção viral. Vacinas de vírus vivo podem mais estritamente simular infecção natural do que vacinas de vírus morto.
Pelo exposto, é possível especular que o processamento de antígeno viral morto é diferente do processamento de antígeno viral vivo modificado (MLV). O processamento de antígenos MLV resultaria em ativação de CD8+ e CD4+ das células T auxiliares, estimulando dessa forma a Resposta Imune Celular (CMI) e a imunidade humoral, isto é plausível porque a função das vacinas MLV, infectando as células, resultaria em produção endógena de proteínas virais que seriam associadas com MHC classe I e, portanto, ativariam a CD8+. Com base na rápida e forte resposta humoral, ficou evidente que ambos os produtos estimularam CD4+ das células T auxiliares e, conseqüentemente, das células R. O processamento das partículas do vírus morto pode ter resultado inicialmente em proteínas solúveis de vírus sendo associadas com MHC classe II, com resultante ativação da célula T auxiliar CD4+ e subseqüente ativação da célula B, levando a uma resposta imune humoral, mas apenas a uma resposta limitada da CD8+.
Assumindo-se que o acima exposto é correto, a diferença observada na resposta clínica entre os tratamentos pode resultar nas razões a seguir. Os bezerros soronegativos (Tratamento III) foram expostos simultaneamente a níveis significativos de vírus IBR e BVD com sensibilização anterior e, como resultado, foi produzida doença severa. Os bovinos vacinados com todos os produtos de vírus mortos tiveram uma boa proteção humoral a BVD (Acredita-se que a proteção contra a BVD dependa da resposta imune humoral mais do que a resposta imune celular), mas pode não ter havido uma proteção tão eficiente contra IBR por causa de uma resposta imune celular (CMI) limitada (diz-se que a proteção contra IBR está fortemente relacionada à resposta imune celular CMI8). O bovino que recebeu vírus quimicamente alterado (termossensível), MLV e vacina de vírus morto teve boa proteção humoral contra BVD e presumivelmente uma melhor resposta CMI contra IBR, que resultou numa redução marcante total na severidade da doença clínica observada neste grupo.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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