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Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.52, n.4, p.313-318,
2000
[Cattle and rabbits immune response against beta
and épsilon Clostridium perfringens toxins
induced by six commercial vaccines in Brazil]
F.C.F. Lobato1, E.Moro2,
O.Umehara2, R.A. Assis1,
N.E. Martins1, L.C.B. Gonçalves
2 |
1Escola
de Veterinária da UFMG
Caixa Postal 567
30123-970 - Belo Horizonte, MG
2Laborátorios Pfizer Ltda.
São Paulo, SP |
| RESUMO |
| Avaliou-se
a resposta de antitoxinas beta e épsilon
de Clostridium perfringens em bovinos vacinados
contra clostridioses com seis vacinas disponíveis
no mercado. Quarenta e oito bezerros de seis
a sete meses de idade foram divididos em oito
grupos (T1 a T8) de seis animais cada. Os
grupos de número 2 a 7 receberam as
vacinas T2 a T7 nos dias 0 e 42 com a dose
e via recomendadas pelos fabricantes. Solução
salina e toxóide padrão foram
usados nos mesmos dias nos grupos 1 e 8 (T1
e T8), respectivamente, como controles negativo
e positivo. Amostras de sangue foram coletadas
nos dias 0, 42 e 56 pós-vacinação
(PV), para titulação de anticorpos
no soro. As vacinas e os controles foram também
testados em oito coelhos cada, inoculados
nos dias 0 e 21 com metade da dose indicada
para bovinos. Os coelhos foram sangrados no
dia 35 e os soros foram misturados em partes
iguais para cada vacina para a titulação
de anticorpos. Os soros dos bovinos foram
titulados individualmente contra os toxinas
beta e épsilon de C. perfringens pelo
método de soroneutralização
em camundongos. A vacina T2 apresentou títulos
de anticorpos de 22,6 e 5,6 UI/ml e a vacina
T4 11,2 e 7,0 UI/ml, respectivamente, contra
toxinas beta e épsilon em coelhos.
Os títulos do toxóide padrão
(T8) foram 45,2 UI/ml contra ambas as toxinas.
Em bovinos, as médias dos títulos
de anticorpos contra a toxina beta nos dias
42 e 56 PV com a vacina T2 (1,15 UI/ml e 8,0
UI/ml) foram similares ao toxóide padrão
(2,02 e 10,03 UI/ml). A vacina T4 (0,73 e
4,54 UI/ml) teve títulos menores (P<0,05)
que o toxóide padrão e similares
a T2. Contra a toxina épsilon, o toxóide
padrão teve média de título
(0,97 UI/ml) no dia 42 que foi significativamente
maior (P<0,05) do que T4 (0,15 UI/ml) e
similar a T2 (0,42 UI/ml). No dia 56, T2 (4,27
UI/ml) teve títulos significativamente
maiores (P<0,05) do que T4 (0,68 UI/ml)
e similares ao toxóide padrão
(4,98 UI/ml). Em cada tratamento, a resposta
aos 56 dias foi superior (P<0,05) em relação
aos 42 dias após a primeira vacinação.
As outras vacinas e a solução
salina não induziram respostas de antitoxinas
beta e épsilon de C. perfringens detectáveis
nos soros dos coelhos e dos bovinos. A vacina
72 induziu altos títulos de anticorpos,
maiores que aqueles induzidos por T4 e similares
ao T8.
Palavras chave: bovino, coelho, vacina,
clostridiose, Clostridium perfringens, anticorpo
antitoxina.
|
|
ABSTRACT |
|
The antibody response against beta and
épsilon toxins of Clostridium perfringens
was evaluated in cattle vaccinated with six
commercial clostridial vaccines. Groups of
six calves (6-7 months old) were vaccinated
with each vaccine (T2 to T7),on days 0 and
42, with the recommended dose and route. Saline
solution (T1) and a standard toxoid vaccine
(T8) were used as negative and positive controls,
respectively. On days 0, 42 and 56 post-vaccination
(PV), blood samples were collected for antibody
titration. Vaccines, as well as controls,
were also injected into 8 rabbits each, on
days 0 and 21, using half of the dose recommended
for cattle. Rabbits were bled on day 35. Rabbit
sera were tested as a pool per vacine and
cattle sera were tested individually against
beta and épsilon toxins, by the serum
neutralization test in mice. The vaccine T2
had antibody titers of 22.6 and 5.6IU/ml and
T4 had 11.2 and 7.0 IU/ml against beta and
épsilon toxins in rabbits, respectively.
The standard toxoid had a titer of 45.2 IU/ml
against both toxins. In cattle, mean antibody
titers against beta toxin on days 42 and 56
PV induced by T2 (1.15 and 8.0 IU/ml) were
similar to those induced by the standard toxoid
(2.02 and 10.3 IU/ml). T4 titers (0,73 and
4,54 IU/ml), were lower (P<0.05) than those
obtained with the standard toxoid, but similar
to T2 titers. On day 42,the standard toxoid
had a mean titer (0.97 IU/ml) against épsilon
toxin significantly higher (P<0.05) than
that obtained with T4 (0.15 IU/ml) but similar
to T2 mean titer (0.42 IU/ml). On day 56,
T2 resulted in a significantly higher titer
(4.27 IU/ml) (P< 0.05) than that induced
by T4 (0.68 IU/ml), but similar to the standard
control (4.98 IU/ml). The other vaccines,
as well the saline solution, did not elicit
antibody responses, neither in rabbits nor
in cattle.T2 induced antibody titers against
C.perfringens beta and épsilon toxins
similar to those induced by the standard toxoid
and higher than those induced by T4.
Keywords: cattle, rabbit, clostridiosis,
clostridial vaccine, Clostridium perfringens,
antitoxin.
|
| INTRODUÇÃO |
|
Enterotoxemia é um termo aplicado
a um grupo de infecções entéricas
dos ruminantes resultantes da absorção
de toxinas produzidas principalmente pelo
C. perfingens no trato intestinal. O microorrganismo
é de ampla distribuição
no mundo e determina um processo infeccioso
de alta letalidade. Condições
predisponentes são necessárias
para a produção de toxinas,
como mudança drástica na alimentação,
voracidade e sobrecarga alimentar. Essas
condições associadas às
mudanças na microflora ruminal com
passagem de alimentos não digeridos
para o intestino delgado produzem meio favorável
para o rápido crescimento do agente
e produção de toxinas (Niilo,
1980). Os animais acometidos são,
em geral, os de melhor condição
corporal e de saúde. Enterotoxemia
por C. perfringens acomete principalmente
animais de três dias e seis meses
de idade. Entretanto, a doença tem
sido descrita em animais adultos (Keat &
Barron, 1954); Itodo et al.,1983; Sigurdarson
& Thorsteinsson, 1990; Silveira et al.,
1995). Na região centro-oeste do
Brasil, a doença é diagnosticada
com maior intensidade em bovinos adultos,
sendo C. perfringens tipo D o mais freqüentemente
envolvido no processo (Silveira et al.,1995).
Devido à alta letalidade e às
características ecológicas
do agente, sendo ubiquitários do
trato intestinal dos animais e do solo e
pela forma de resistência na natureza
através de esporos, a erradicação
das enfermidades causadas pelos clostrídios
é praticamente impossível.
O controle e a profilaxia devem basear-se
em medidas adequadas de manejo e principalmente
na vacinação de todo o rebanho
com imunógenos eficientes, já
que os animais estão em permanente
contato com os agentes e com os fatores
que poderão desencadear as enfermidades.
Embora o diagnóstico de enterotoxemia
seja normalmente baseado no histórico,
nos sinais clínicos e nos achados
de necropsia, a análise de laborátorio
é de fundamental importância
para a confirmação da presença
de toxinas produzidas pelo C. perfringens
(Sterne & Batty, 1975). A produção
de toxinas beta e épsilon está
associada aos biótipos: tipo B produz
toxinas beta e épsilon, tipo C produz
toxina beta e tipo D produz toxina épsilon
(European...,1998).
No Brasil, atualmente está havendo
incremento na produção e uso
de vacinas contra as clostridioses. Em 1999,
foram produzidas 116 milhões de doses
de vacinas, 55 milhões delas de vacinas
polivalentes com diferentes combinações
de C. perfringens, C. chauvoei, C. septicum,
C. sordellii e C. novyi, (Neves, R.D.,1
comunicação pessoal).
Entretanto, apenas C. botulinum e C. chauvoei
são submetidos a controle oficial
de potência (Brasil, 1994, 1997).
Azevedo et al. (1998) testaram a resposta
de antitoxinas beta e épsilon de
C. perfringens induzida em coelhos por sete
vacinas comerciais no Brasil (seis produzidas
localmente e uma importada) e observaram
que somente a vacina importada induziu respostas
de anticorpos neutralizantes. O objetivo
do presente estudo foi o de avaliar a resposta
de antitoxinas beta e épsilon de
C. perfringens em bovinos e coelhos induzida
por seis vacinas comerciais disponíveis
no mercado brasileiro.
1Ronaldo Dias Neves - LARA /POA
- Estrada Ponta Grossa, 3036, 91785-340-Porto
Alegre, RS.
Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.52, n.4,
p.313-318,2000
|
| |
| MATERIAL
E MÉTODOS |
Seis
vacinas polivalentes (tratamentos) contra
as clostridioses contendo C. perfringens tipos
C e D na composição foram usadas neste experimento.
Um toxóide padrão C. perfringens tipos C e
D (National Institute for Biological Standardization
and Control - UK) e solução salina foram usados
como controle positivo e negativo. A composição
antigênica das vacinas de acordo com as respectivas
bulas é apresentada na Tab. 1.
|
Tabela 1. Composição
antigênica das vacinas clostridiais testadas
| Vacina
|
Composição
Antigênica |
| T2 |
C.chauvoei,
C. septicum, C. novyi, C. sordellii,
C.perfringens tipos C e D. |
| T3 |
C.chauvoei,
C. septicum, C. novyi, C.perfringens
tipos C e D. |
| T4 |
C.chauvoei,
C. septicum, C.perfringens tipos B,
C e D. C. novyi, C. tetani, C. sordelli |
| T5 |
C.chauvoei,
C. perfringens tipos B, C e D. C. novyi,
C. septicum, C. sordelli |
| T6 |
C.chauvoei,
C. septicum, C. novyi, C.perfringens
tipos B, C e D., C. sordelli |
| T7 |
C.chauvoei,
C. novyi, C. sordelli, C. perfringens
tipos B, C e D., C. septicum, C. tetani |
| T8
- Toxóide Padrão(NIBSC)* |
C.
perfringens tipos C e D. |
* National Institute For
Biological Standardization and Control -UK
Tabela 2. Esquema de vacinação
e sangria dos bovinos vacinados com os toxóides
C e D de
C. perfringens.
| Grupo
|
Número
de Animais |
Dose |
Vacinação-dia |
Sangria-dia |
|
1º
dose |
2º
dose |
1º |
2º |
3º |
T1(Solução
salina)
|
6 |
5ml |
0 |
42 |
0 |
42 |
56 |
| T2 |
6 |
5ml |
0 |
42 |
0 |
42 |
56 |
| T3 |
6 |
3ml |
0 |
42 |
0 |
42 |
56 |
| T4 |
6 |
3ml |
0 |
42 |
0 |
42 |
56 |
| T5 |
6 |
3ml |
0 |
42 |
0 |
42 |
56 |
| T6 |
6 |
3ml |
0 |
42 |
0 |
42 |
56 |
| T7 |
6 |
5ml |
0 |
42 |
0 |
42 |
56 |
| T8 |
6 |
2ml |
0 |
42 |
0 |
42 |
56 |
SC= Subcutânea
|
Soros
de 48 bezerros identificados com brincos numerados,
machos e fêmeas com idade de seis a sete meses
e sem histórico de vacinação prévia contra
as clostridioses, foram testados para a presença
de antitoxinas beta e épsilon de C. perfringens
pelo teste de soroproteção (Tammemagy & Grant,
1967). Os animais, negativos para a presença
de antitoxinas beta e épsilon de C. perfringens,
foram distribuídos ao acaso em oito grupos
(T1 e T8) no dia 0. Eles permaneceram juntos
em pasto separado dos demais animais de fazenda.
Os bovinos de cada grupo, com exceção dos
tratamentos T1 e T8, foram vacinados segundo
a dosagem e via indicadas nas respectivas
bulas (Tab. 2). Os animais do grupo T1 receberam
solução salina e os do grupo T8 receberam
o toxóide padrão como controle negativo e
positivo, respectivamente. Todos os animais
receberam uma segunda dose no dia 42 após
a primeira vacinação.
As inoculações foram feitas por via subcutânea
na tábua do pescoço. Amostras de sangue foram
coletadas por punção da veia jugular nos dias
0 e 42, antes de cada vacinação, e no dia
56 pós-vacinação para as provas sorológicas.
Após as vacinações, os animais foram observados
por duas horas para possíveis reações adversas.
Os soros obtidos das amostras de sangue foram
estocadas a -20oC até a realização
dos testes. Cada amostra de soro foi titulada
individualmente. Grupos de oito coelhos cada,
da raça Nova Zelândia, de ambos os sexos e
com pesos entre 1,8 e 2,6kg, foram vacinados
com cada uma das vacinas e os controles, pela
via subcutânea, com metade da dose recomendada
para bovinos. Os coelhos receberam uma segunda
dose das respectivas vacinas 21 dias após
a primeira dose. No dia 35 PV (14 dias após
a segunda vacinação), todos os coelhos foram
sangrados e os soros dos oito coelhos de cada
vacina foram misturados em partes iguais e
estocados a -20oC até o momento
dos testes sorológicos (European....,1998).
Para a produção das toxinas beta e épsilon,
amostras de referência de C. perfringens tipo
C (ATCC 3628) e D (ATCC 3629) foram cultivadas
em meio contendo tripticase (3%), extrato
de levedura (2%), glicose (0,1%) e L-cisteína
(0,1%), em atmosfera de anaerobiose a 37oC
por oito horas. As culturas foram centrifugadas
a 10.000xg por 20 minutos e os sobrenadantes
obtidos foram concentrados em sistema Amicom
em uma membrana com capacidade de retenção
de 10kDa e mantidos a -70oC até
o momento do uso. As toxinas beta e épsilon
de C. perfringens tipos C e D foram tituladas
em camundongos, segundo Azevedo et al. (1998).
Cada soro-teste foi misturado com toxinas
beta e épsilon de C. perfringens. As misturas
foram preparadas na proporção de 0.1ml de
soro puro e 0,1ml contendo 2,5DL50 de toxina
beta ou 5,0 DL50 de toxina épsilon (Tammemagy
& Grabt,1967). Uma suspensão contendo 2,5DL50
de beta ou 5,0DL50 de toxina épsilon em 0,2ml
foi usada para controle das toxinas. As misturas
soro-toxinas e controles foram homogeneizadas
e incubadas em banho-maria a 37oC
por 30 minutos e cada mistura foi inoculada
por via intravenosa com dose de 0,2ml em dois
camundongos Swiss, cepa Webster, com peso
entre 17 e 22g.
Os camundongos foram observados durante três
dias após inoculação sendo anotados o número
de mortos e sobreviventes. Os animais cujos
soros resultaram em mortos dos comundongos
foram considerados negativos ou sem anticorpos
detectáveis e anotados como zero. Esse procedimento
foi usado para a seleção dos animais negativos
para serem usados no experimento e também
como triagem dos soros dos coelhos e bovinos
vacinados, antes da titulação pelo metódo
de soroneutralização. As amostras de soro
dos bezerros ou os "pools" dos soros de coelhos
que protegem os camundongos no teste de soroproteção
foram tituladas pelo metódo de soroneutralização
em camundongos. Preparam-se diluições seriadas
ao dobro do soro com solução salina contendo
1% de peptona e sobre 1,0ml de cada diluição,
acrescentou-se 1,0ml da toxina beta ou épsilon
padronizadas segundo a European...,(1998)
ao nível de L+/10 (menor quantidade de toxina
que misturada a 0,1IU/ml de antitoxina padrão
homóloga matará 50% dos camundongos inoculados.
As misturas foram incubadas em banho-maria
a 37oC por 30 minutos e 0,2ml de
cada diluição foram inolucados via intravenosa
em cinco camundongos. Após inoculação, os
camundongos foram observados por três dias
anotando-se os números de mortos e sobreviventes.
O título 50% de neutralização de cada soro
foi calculado pelo método de Reed & Müench
(1938) e expresso em UI/ml. Em cada teste,
foi incluída a mesma quantidade de
soros de cada vacina. Os títulos de anticorpos
contra as toxinas beta épsilon C. perfringens
foram analisados pelo método não paramétrico
de Kruskal-Wallis e as comparações entre os
títulos de anticorpos foram feitas pelo teste
t de Student. O nível de significância foi
fixadoem 0,05 (Sampaio 1998). |
| |
| RESULTADOS
E DISCUSSÃO |
| Todos
os animais estavam clinicamente sadios durante
todo o período experimental e não apresentaram
antitoxinas beta e épsilon antes do início
do estudo. As vacinas T2 e T4 induziram respostas
satisfatórias de antitoxinas beta e épsilon
de C. perfringens em coelhos (Tab. 3) cujos
títulos foram superiores aos títulos mínimos
exigidos de 10 UI/ml e 0,5 UI/ml, respectivamente,
para aprovação da vacina (European...,1998).
O toxóide padrão (T8) também induziu altos
títulos de anticorpos contra ambas as toxinas
(Tab. 3). As médias dos títulos de anticorpos
foram: vacina T2 = 22,6 UI/ml e 5,6 UI/ml;
vacina T4 = 11,2 UI/ml e 7,0 UI/ml contra
toxinas beta e épsilon, respectivamente, e
toxóide padrão = 45,2 UI/ml contra ambas as
toxinas. Os soros dos coelhos vacinados com
as demais vacinas e a solução salina não apresentam
níveis de antitoxinas detectáveis com a dose
teste empregada. Esses resultados confirmam,
em parte, os obtidos por Azevedo et al. (1998)
que testaram sete vacinas no Brasil, das quais
seis eram de fabricação nacional e uma era
importada, e somente a vacina importada e
o toxóide padrão usado como controle induziram
respostas satisfatórias nos coelhos vacinados.
O presente estudo mostra que também em bovinos
somente as vacinas T2, T4 e o toxóide padrão
(T8) induziram títulos de anticorpos neutralizantes
das toxinas beta e épsilon (Tab.4). Os títulos
de antitoxina beta nos dia 42 e 56 após a
primeira vacinação, induzidos pelo T8 (2,02
e 10,03 UI/ml, respectivamente), foram significativamente
(P<0,05) maiores do que os títulos induzidos
pela vacina T4 (0,73 e 4,54 UI/ml), mas foram
similares aos títulos induzidos por T2 (1,15
e 8,0 UI/ml). Contra a toxina épsilon, a média
de anticorpos aos 42 dias após a primeira
vacinação induzidos pelo toxóide padrão (0,97
UI/ml) foi significativamente (P<0,05) maior
do que T4 (0,15 UI/ml) e similar a T2 (0,42
UI/ml). Aos 56 dias após a primeira vacinação,
T2 teve média de títulos de anticorpos (4,27
UI/ml) significativamente (P<0,05) mais elevada
do que T4 (0,68 UI/ml) e similar ao toxóide
padrão (4,98 UI/ml). Em cada tratamento, a
resposta aos 56 dias foi superior (P<0,05)
em relação aos 42 dias após a primeira vacinação.
Esses níveis mais elevados de anticorpos após
a vacinação "booster" estão de acordo com
os estudos de Sterne et al.(1962) e Jansen
(1967), que mostraram a importância da vacinação
de reforço para adequada imunidade. Na literatura
consultada há escassez de trabalhos relacionados
à determinação de anticorpos neutralizantes
para toxinas beta e épsilon em bovinos. Kennedy
et al. (1977 a,b) detectaram títulos de 10
UI/ml e 5 UI/ml para antitoxinas beta e épsilon,
respectivamente, entretanto os níveis de teste
empregados foram inferiores aos utilizados
neste estudo, não sendo compatíveis com a
metodologia proposta pela European... (1998).Os
resultados obtidos nos coelhos e bovinos no
presente estudo permitem inferir que existe
boa correlação entre o teste de potência em
colhos e a reposta imunológica em bovinos,
pois somente as vacinas que foram aprovadas
no teste em coelhos apresentaram respostas
de anticorpos neutralizantes também em bovinos.
Entretanto, novos estudos são necessários
para estabelecer os níveis minímos de anticorpos
protetores frente ao desafio de campo. As
vacinas T2 e T4 e o toxóide padrão induziram
altos títulos de anticorpos contra as toxinas
beta e épsilon nos coelhos e nos bovinos.
As demais vacinas ou a solução salina näo
induziram respostas de anticorpos neutralizantes
detectáveis nem nos colehos nem nos bovinos.
Näo se observaram sinais clínicos de reações
adversas em nenhum dos animais vacinados.
|
Tabela 3. Títulos de antitoxinas beta
e épsilon de C. perfringens nos soros
dos coelhos, coletados aos 35 dias após
a primeira vacinação com imunógenos
comercias e toxóide padrão,
ao nível de L+/10.
| Grupo
|
Antitoxina
beta(UI/ml) |
Antitoxina
épsilon(UI/ml) |
| T1(Solução
salina) |
0 |
0 |
| T2 |
22,6 |
5,6 |
| T3 |
0 |
0 |
| T4 |
11,2 |
7,0 |
| T5 |
0 |
0 |
| T6 |
0 |
0 |
| T7 |
0 |
0 |
| T8(toxóide
padrão) |
45,2 |
45,2 |
Tabela 4. Média dos títulos
de antitoxinas beta e épsilon de C.
perfringens nos soros dos bovinos, coletados
aos 42 e 56 dias após a primeira vacinação
com imunógenos comerciais e toxóide
padrão, ao nível L+/10.
| Grupo |
Antitoxina
beta (UI/ml) |
Antitoxina
épsilon (UI/ml) |
| Dia
0 |
Dia 42 |
Dia
56 |
Dia
0 |
Dia
42 |
Dia 56 |
| T1(Solução
salina) |
0 |
0 |
0
|
0 |
0
|
0 |
| T2 |
0 |
1,15abB |
8,0abA |
0 |
0,42abB |
4,27aA |
| T3 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
| T4 |
0 |
0,73bB |
4,54bA |
0 |
0,15bB |
0,68bA |
| T5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
| T6 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
| T7 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
| T8(Toxóide
padrão) |
0 |
2,02aB |
10,03aA |
0 |
0,97aB |
4,98aA |
Nas
colunas, médias com pelo menos uma
letra minúscula comum são equivalentes
Nas linhas, médias com letras maiúsculas
comuns são equivalentes.
Testes Kruskal Wallis e t de Student (p<0,05)
|
REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
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Portaria nº 051, 16/07/1994 [comunicado
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Portaria nº 49, 12 de maio de 1997.
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